MitoSpy? Orange和 MitoSpy? Red定位于線粒體是基于膜電位，因此MitoSpy? Orange和 MitoSpy? Red能很好的反應細胞的健康狀態(tài)和定位。MitoSpy?Orange CMTMRos和MitoSpy?Red CMXRos含有一個氯甲基團，它能共價與細胞中的半胱氨酸連接，這使得細胞在經(jīng)過固定破膜后，仍能保持在細胞中。但由于固定破膜過程中洗掉了大部分的試劑，所以這需要使用更高的試劑濃度來獲得充分的染色（具體濃度可參考下表）。

        而MitoSpy? Green FM不同于之前的兩個，它定位于線粒體不是基于膜電位。它不含有氯甲基，而是含有氟甲基，所以固定破膜之后，大部分的MitoSpy? Green會被洗掉。所以需要固定破膜的樣本，不建議使用該試劑。

          NIH3T3 cells were stained with 100 nM of MitoSpy? Red CMXRos (red) for 20 minutes at 37°C, fixed with 1% paraformaldehyde (PFA) for ten minutes at room temperature, and permeabilized with 1X True Nuclear? Perm Buffer for ten minutes at room temperature. Then the cells were stained with Flash Phalloidin? NIR 647 (green) for 20 minutes at room temperature and counterstained with DAPI (blue). The image was captured with a 60x objective

Live staining (50 nM)            Fix/Perm staining(500nM)

MitoSpy? Orange

MitoSpy? Green

        而對于MitoSpy? Green，但現(xiàn)在MitoSpy? Green FM的完整機制還不是很清楚，可能與該試劑的結構和線粒體表面的蛋白之間的同源性相關。由于該試劑的膜電位的獨立性，可以用于流式中測量單個細胞的線粒體量。