先前小達(dá)君給大家介紹了Strep-tag? 的歷史（點此回顧您想了解的Strep-tag：Strep-Tactin?XT發(fā)展史都在這里！），現(xiàn)在再隆重介紹 Strep-tag? 在哺乳類細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。另外，小達(dá)君保證您看完后會心動，然后回來參加活動（點此參加分享IBA蛋白純化體驗，獲贈蛋白純化填料哦！），獲贈蛋白純化填料哦！

雖然大腸桿菌E.coli表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)實惠，但由于缺乏重要的脂類，分子螫合物，以及重要的翻譯后修飾，用它表達(dá)真核蛋白，可能會影響蛋白本身的折疊及功能，以膜蛋白為例，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能影響目標(biāo)蛋白在細(xì)胞膜的插入位置及其應(yīng)有的功能^[1]。除此之外，當(dāng)目標(biāo)蛋白大于50kDa時，使用大腸桿菌系統(tǒng)可能表達(dá)出不完整的蛋白^[2]。

所以，為了研究特定蛋白的功能（如：信號通路），生產(chǎn)較大型的蛋白，或進(jìn)行高解析度的結(jié)構(gòu)分析，愈來愈多的實驗室選擇哺乳類表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)融合蛋白。其原因為哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)出的重組蛋白與人類蛋白十分相似，有較完整的蛋白折疊、組合及翻譯后修飾^[3]。因此，愈來愈多科學(xué)家們更加關(guān)注于—如何從哺乳類細(xì)胞中高效的純化目標(biāo)蛋白。

首先，需考慮選擇合適的親和標(biāo)簽。常用于哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的親和標(biāo)簽有His-tag、FLAG-tag、GST-tag及Strep-tag?等^[4-12]，整理于下表：

*這些親和標(biāo)簽在使用上各有千秋。

使用His-tag時，常遇到的問題是寄主蛋白與填料的非特異性結(jié)合，在哺乳動物重組蛋白的純化過程中，這樣的情況更為明顯。由于系統(tǒng)中有很多含有組氨酸（histidine）的殘基的蛋白，這種蛋白結(jié)構(gòu)與his-tag相似，容易與鎳柱結(jié)合，因此導(dǎo)致目標(biāo)蛋白純度降低^[13]。

FLAG-tag系統(tǒng)可在非變性條件下進(jìn)行純化，能得到高純度、有活性的蛋白，但其缺點為純化介質(zhì)較為不穩(wěn)定，且純化成本高上許多^[5]。

另一常用的標(biāo)簽為GST-tag，一個26kDa的蛋白，其特點是表達(dá)量高，具高度抗原性，常用來增加目標(biāo)蛋白的溶解度，但常常會影響目標(biāo)蛋白的特性，一般推薦純化后將標(biāo)簽去除^[8]。

而Strep-tag?（包含Strep-tag?II或是Twin-Strep-tag?），都是短肽標(biāo)簽，分別為8或28個氨基酸，一般不干擾蛋白折疊或活性，因此適合用于蛋白功能性研究^[5]。Strep-tag?可以特異性地結(jié)合在Strep-Tactin?(二代介質(zhì))或Strep-Tactin?XT(三代介質(zhì))的生物素的結(jié)合位點。洗脫時使用的脫硫生物素（適用于二代）或生物素（三代），對同樣的結(jié)合位點有更高的親和力，能將目標(biāo)蛋白從同樣位置移除，因此得到的目標(biāo)蛋白純度一般高于95%^[12]。

同時，三代的 Strep-Tactin?XT與Strep-tag?蛋白的親和力大幅提升，直接加入含目標(biāo)蛋白的哺乳細(xì)胞的培養(yǎng)上清，即可高效純化出所需蛋白（注：原本使用二代需先以Avidin或是BioLock將培養(yǎng)基中的生物素遮蔽，才不會影響純化表現(xiàn)）。

圖A比較了His-tag與Strep-tag?直接加入哺乳細(xì)胞培養(yǎng)上清純化目標(biāo)蛋白的表現(xiàn)。

圖A

圖A：分別向Strep-Tactin?XT High Capacity 1ml重力柱（左）和Ni-NTA 1ml重力柱（右）中，同時加入含4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST)或mCherry-His-tag (His)螢光蛋白的ExpiCHO細(xì)胞培養(yǎng)上清（注：接下來的實驗皆是取哺乳細(xì)胞表達(dá)某抗體后的上清，另加入高純度目標(biāo)蛋白進(jìn)行實驗)。由圖可見，Strep-Tactin?XT（左）能高效率的捕捉mCherry-TST，而右方的mCherry-His幾乎無法掛柱。

此外，我們也測試了其他的蛋白，例如SEAP（72 kDa）或抗體（mAb，其重鏈為55kDa）。圖B為以Strep-Tactin?XT純化SEAP-TST、mCherry-TST與mAb-TST的SDS-PAGE分析結(jié)果，可見對于不同蛋白，Strep-tag?系統(tǒng)都能純化出高純度的目標(biāo)蛋白。(注:紅色標(biāo)記處為 mCherry的降解產(chǎn)物，非雜帶)

圖B

因Strep-Tactin?XT與Twin-Strep-tag蛋白的高親和力，即使目標(biāo)蛋白的濃度低，使用Strep-Tactin?XT仍可以有效的捕捉上清中的目標(biāo)蛋白。表C整理了幾個實驗的數(shù)據(jù)，顯示當(dāng)目標(biāo)蛋白濃度低于20μg/ml時，得率仍能達(dá)到幾近100%。

表C

除了上述實驗所用的CHO細(xì)胞株外（中國倉鼠卵巢細(xì)胞），另一常用于生產(chǎn)蛋白的哺乳動物細(xì)胞株為HEK293(人胚胎腎細(xì)胞)，使用上較CHO簡單。我們測試了Strep-Tactin?XT的純化表現(xiàn)：表D1為以Expi293表達(dá)SEAP-TST或mAb-TST蛋白后，目標(biāo)蛋白的濃度。圖D2為純化表現(xiàn)的SDS-PAGE分析。從中可知，與ExpiCHO培養(yǎng)基相同，直接將表達(dá)好的Expi293上清加入1ml Strep-Tactin?XT高載量重力柱中進(jìn)行純化，一樣能夠快速的得到高純度的目標(biāo)蛋白。

表D1

圖D2

綜上所述，Strep-tag?非常適合用在哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)目標(biāo)蛋白，其純化過程也與常見的ExpiCHO及Expi293培養(yǎng)基相容，不須另外處理，讓實驗流程更為便利。加上Strep-tag?系統(tǒng)在純度上的優(yōu)勢，是目前在這個應(yīng)用上的絕佳選擇。

表E1 含Twin-Strep-tag?的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體

表E2 pCSG與pESG的區(qū)別

表E3 IBA三代產(chǎn)品信息

參考文獻(xiàn)

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[10] Thermo Fisher Scientific (2015). Protein Expression Handbook

[11] Dynamic Biosensors (2018) Application Note: High-affinity capturing of tagged proteins on the switchSENSE? biochip using Strep-Tactin?XT.

[12] IBA Lifesciences (2016) Application Note: Strep-Tactin?XT:Twin-Strep-tag?- Advantages compared to the His-tag purification system.

[13] Bornhorst JA, Falke JJ (2000). Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol., 326:245-54.

IBA lifesciences（德國）：IBA公司總部位于德國。二十年來，IBA以杰出的專利技術(shù)Strep-tag?系統(tǒng)為基礎(chǔ)，發(fā)展出完整的產(chǎn)品組合，涵蓋重組蛋白表達(dá)純化與固定以及特定細(xì)胞從全血或相關(guān)體液中分離的技術(shù)。同時，IBA也是全球領(lǐng)先的核酸合成專家，在DNA及RNA寡核苷酸的合成上已有超過二十年的經(jīng)驗，能根據(jù)客戶的選擇，生產(chǎn)含有特定染料或化學(xué)修飾的特殊寡核苷酸。